*Bacillus thuringiensis* var. *kurstaki* : Un biopesticide sélectif pour la protection des cultures

Introduction

Le Bacillus thuringiensis (souvent abrégé en Bt) est une espèce de bactérie reconnue pour ses propriétés insecticides. Ce bacille Gram positif, aérobie facultatif, est ubiquiste et sporulé, se retrouvant en faible quantité dans pratiquement tous les sols, l'eau, l'air et le feuillage des végétaux. Il fait partie du groupe des « Bacillus cereus », qui comprend également des espèces comme B. anthracis (responsable de la maladie du charbon) et B. cereus.

Le Bacillus thuringiensis a été isolé pour la première fois en 1901 par le bactériologiste japonais S. Ishiwata à partir de vers à soie, qu'il peut infecter et tuer. Sa description scientifique initiale est attribuée à l'Allemand Ernst Berliner en 1911. Historiquement, l'intérêt pour les vertus entomotoxiques du Bacillus thuringiensis a émergé dès les années 1920 et 1930, avec des essais de lutte biologique conduits en Hongrie et en Yougoslavie pour contrôler les insectes, notamment les Lépidoptères. Cet intérêt s'est renouvelé de manière plus marquée à la fin du XXe siècle, grâce aux avancées du génie génétique et au développement de l'agriculture biologique.

En 2006, le Bt était le biopesticide le plus utilisé, représentant plus de 90 % du marché des bioinsecticides, bien qu'il ne constitue qu'à peine 2 % du marché global des insecticides (Fargues et Bourguet 2005). Il est également produit par les plantes transgéniques, bien que certaines espèces d'insectes y soient devenues résistantes dans certains cas. Le Bacillus thuringiensis se distingue des autres bacilles du groupe cereus par sa capacité à synthétiser et excréter des δ-endotoxines, des cristaux protéiques (Cry) mortellement toxiques pour certains insectes et invertébrés. Ces cristaux ne sont pas minéraux, mais sont formés par l'association de plusieurs protéines, lesquelles possèdent une propriété insecticide sur les larves de lépidoptères, les coléoptères et/ou les diptères. Actuellement, plus de 14 gènes codant ces protéines, dénommées "Cry" (pour protéine cristal), sont connus des biochimistes. Ces inclusions de cristaux peuvent représenter 20 à 30 % du poids sec des cellules sporulées. Les protéines Cry sont des protoxines d'environ 70 kDa ou 130 kDa, dont la forme toxique est de 66-67 kDa (moitié N-terminale du précurseur), et sont classées parmi les toxines formant des pores transmembranaires (Pore-Forming Toxin ou PFT) dans la catégorie des toxines en hélices-α. Plus de 150 protéines Cry ont été découvertes rien que chez B. thuringiensis.

Le rôle spécifique de Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Btk)

Le Bacillus thuringiensis sous-espèce kurstaki, plus communément appelé Btk, est une variété de cette bactérie naturellement présente dans le sol, l'eau et sur la végétation. Il est particulièrement apprécié pour sa capacité à stopper l'alimentation des chenilles avant que les feuilles ne subissent des dégâts importants. Contrairement aux méthodes de lutte antiparasitaire classiques qui agissent à grande échelle et peuvent affecter de nombreux organismes, le Btk est très sélectif. Il perturbe le système digestif d'un groupe très précis de larves dévoreuses de feuilles.

Le Btk ne doit pas être confondu avec un engrais, un stimulant de croissance ou un micro-organisme du sol favorisant le développement racinaire ; il s'agit d'un outil de lutte biologique contre les ravageurs. Son mode d'action repose sur la production d'une protéine cristalline qui se transforme en toxine. Lorsque la chenille ingère ces protéines spécifiques, les cristaux se dissolvent et s'activent dans l'intestin alcalin de la larve. Les protéines activées se lient à des cellules spécifiques de la paroi intestinale, créant de petites ouvertures qui perturbent la digestion. L'ingestion d'une dose suffisante du produit par les larves de lépidoptères entraîne la solubilisation des cristaux dans le milieu alcalin du tractus digestif, libérant ainsi de longues chaînes de protéines (pro-toxines ou delta-endotoxines). Celles-ci sont par la suite sectionnées par des enzymes (protéases) pour produire les segments toxiques (les toxines). Ces toxines se fixent sur des récepteurs situés sur la membrane des cellules de la paroi médiane du tractus digestif et induisent un déséquilibre biochimique. Les cellules affectées se gonflent et éclatent, causant la perforation de la paroi du tube digestif et l'épanchement des sucs digestifs dans le corps. Cela favorise la germination des spores ingérées ainsi que la multiplication des cellules végétatives et provoque une septicémie qui contribue à la mort de la larve, qui survient dans les 2 à 5 jours.

Sélectivité et spécificité d'action du Btk

L'action du Btk est hautement sélective et spécifique sur le plan biologique. Il est sans effet sur les abeilles, les organismes du sol, les coccinelles et tous les autres auxiliaires du jardin. Il reste inactif jusqu'à ce qu'il soit ingéré par une chenille, puis se décompose naturellement sous l'effet de facteurs environnementaux tels que la lumière du soleil ou la pluie.

Le Btk cible uniquement les larves de papillons, en particulier celles qui se nourrissent en dévorant les feuilles. Ces larves peuvent causer des dégâts rapides, car elles consomment souvent plusieurs fois leur poids en feuillage chaque jour. Des plantes qui semblent saines le matin peuvent présenter des dommages importants le soir même, lorsque les jeunes chenilles commencent à se nourrir abondamment. Lorsqu'une chenille ronge une feuille traitée, elle absorbe immédiatement les protéines Btk, ce qui rend le traitement particulièrement efficace lors de l'émergence des jeunes larves.

Le Btk est sans effet sur les papillons adultes, les papillons de nuit et les papillons de jour. Il n'agit pas non plus sur les œufs et n'infecte pas les larves qui ne rongent pas activement la surface de la plante.

Application et efficacité du Btk

Le Btk est généralement appliqué sous forme de pulvérisation sur les feuilles et les tiges des plantes infestées par les chenilles. Il est important de suivre les instructions figurant sur l'étiquette du produit pour déterminer la dose appropriée et la fréquence d'application. Il est recommandé de pulvériser le Btk tôt le matin ou en fin de journée, lorsque les chenilles sont actives et que les températures sont plus fraîches. Pour de meilleurs résultats, un traitement doit être effectué dès l'apparition des chenilles, lorsqu'elles sont petites et jeunes et qu'elles s'alimentent activement. Le produit est efficace lorsque la larve est dans une phase d'alimentation active. Au stade adulte (papillon), il est malheureusement trop tard.

De nombreux jardiniers s'attendent à un résultat visible immédiatement, mais le Btk agit de l'intérieur bien avant que la chenille ne présente des signes extérieurs de souffrance. L'indicateur clé pour les producteurs est l'arrêt brutal de l'alimentation de la chenille. Cet arrêt d'alimentation protège la plante instantanément, lui permettant de conserver sa structure foliaire et de poursuivre sa photosynthèse. Une fois que la chenille cesse de se nourrir, la plante est protégée. L'absence de nouveaux dégâts sur les feuilles est le signe le plus clair que le Btk a commencé à agir. La chenille peut rester visible un court instant, mais, cessant de ronger, elle devient inoffensive. La plante peut ainsi se rétablir rapidement, surtout si les dégâts sont survenus au début de son développement.

Identification des signes d'infestation par les chenilles

Les producteurs qui savent repérer rapidement la présence de chenilles réussissent bien mieux à préserver la santé de leurs plantes. L'un des premiers signes est l'apparition de bords de feuilles irréguliers ou déchiquetés. Les chenilles découpent rarement le feuillage de façon nette ; elles le rongent plutôt de façon irrégulière et laissent souvent des fragments. Un autre signe est la présence de minuscules excréments foncés sur ou sous les feuilles, indiquant que des larves se sont nourries à proximité. Parfois, la plante peut présenter de petits trous qui s'agrandissent rapidement dans les jours suivants. Savoir distinguer les dégâts foliaires causés par les chenilles de ceux causés par une maladie ou un stress environnemental permet d'éviter les erreurs de diagnostic. Les chenilles laissent des déchirures et des irrégularités distinctes sur les feuilles, tandis que les maladies provoquent souvent des taches ou des décolorations plutôt que des pertes de tissu foliaire.

Durée d'activité et facteurs environnementaux

Étant un produit microbien vivant et non un composé synthétique, la durée d'activité du Btk sur les plantes est fortement influencée par les facteurs environnementaux. La lumière du soleil décompose progressivement les cristaux de protéine, surtout lors d'une exposition intense en milieu de journée. La pluie, l'irrigation ou l'arrosage par aspersion peuvent également réduire la présence de Btk en l'éliminant des feuilles. En cas de fortes précipitations peu après l'application, il peut être nécessaire de renouveler le traitement afin de garantir l'ingestion d'une quantité suffisante par les larves. Les feuilles poussiéreuses ou recouvertes de résidus peuvent également réduire la probabilité que les larves absorbent suffisamment de Btk pour déclencher la digestion.Un autre facteur influent est l'âge des larves. Les jeunes chenilles ont un système digestif plus petit et plus sensible et réagissent généralement plus rapidement à l'ingestion de Btk. Les larves plus âgées, complètement développées, peuvent nécessiter une exposition plus longue avant l'arrêt de leur alimentation. Leur masse corporelle plus importante leur permet de mieux supporter le stress avant de succomber.

Les toxines produites par Bacillus thuringiensis peuvent persister dans les sols pendant plusieurs mois. En revanche, les demi-vies typiques des produits de Bacillus thuringiensis sont de 1 à 4 jours sur le feuillage. Les spores produites par ce micro-organisme peuvent persister dans l'environnement, mais elles ne sont pas toxiques. Selon N. Helassa (2008), l'adsorption de la toxine sur les argiles du sol est une interaction de faible affinité, fortement dépendante du pH mais difficilement réversible (d'après des tests faits sur de la montmorillonite). Dans un sol argileux, la mobilité de la protéine dépendra alors de l'érosion, des transports de colloïdes et du degré de bioturbation du sol concerné.

Des travaux ayant porté sur la persistance de la toxine Bt dans le sol ont conclu que (dans les conditions de cette étude) plus de 50 % de l'immuno-réactivité de la toxine était perdue en moins de 7 jours ; la dégradation semble ne pas être due à des microbes : « la toxine ne soit pas dégradée mais plutôt inactivée par des changements de conformations suite à son interaction avec les composants du sol ». Des études (au champ et en laboratoire) visent à améliorer la compréhension des phénomènes d'adsorption/désorption de la protéine Bt dans le sol.

Impacts sur la croissance des plantes

Bien que le Btk ne soit pas un nutriment, les ravageurs affectent indirectement la croissance des plantes. Les chenilles se nourrissent agressivement des feuilles, réduisant ainsi la capacité de la plante à effectuer la photosynthèse. Les feuilles étant responsables de la captation de la lumière et de sa conversion en énergie utilisable, leur perte en trop grand nombre soumet la plante à un stress immédiat. En empêchant la perte de tissu foliaire, le Btk permet à la plante de maintenir sa production d'énergie. Cette préservation du feuillage précoce est particulièrement cruciale pour les cultures à croissance végétative rapide. Par exemple, les jeunes plants qui perdent trop de feuilles peuvent avoir du mal à développer des tiges robustes ou produire des feuilles plus petites par la suite. Une infestation précoce de chenilles peut compromettre la croissance de toute une saison.

La question de la toxicité et de la sécurité du Bacillus thuringiensis

Le Bacillus thuringiensis est un micro-organisme qui vit à l'état naturel dans les sols. Toute personne qui entre en contact avec le sol risque donc d'y être exposée. Les risques pour la santé sont considérés comme négligeables par l'Agence américaine de protection de l'environnement, que l'exposition se fasse par voie orale, cutanée ou respiratoire. L'EPA a conclu que l'exposition globale par ces voies à des populations du bacille présentes à l'état naturel dans les sols ou par suite de l'utilisation de produits antiparasitaires ne devrait pas poser de risque pour la santé humaine.

Les δ-endotoxines du B. thuringiensis doivent leurs effets sur les insectes à un mécanisme bien connu s'amorçant avec leur fixation sur des sites récepteurs particuliers de la membrane cellulaire de l'intestin. Chez les espèces de mammifères, il n'existe pas de site équivalent qui pourrait conduire à de tels effets, et ce, peu importe l'âge des sujets exposés. De plus, la gamme d'essais de toxicité et de pathogénicité aiguës est suffisante pour réaliser une évaluation adéquate du risque posé par les agents antiparasitaires microbiens. En conséquence, l'EPA a conclu qu'il était raisonnable de penser que l'exposition par voie alimentaire à des résidus de B. thuringiensis était sans danger.

Cas spécifiques de toxicité et préoccupations environnementales

La thuringiensine purifiée inhalée présente une toxicité pulmonaire significative chez le rat de laboratoire (souche Sprague-Dawley, traité via l'instillation intratrachéale) avec des doses allant de 0,4 à 9,6 mg de thuringiensine par kg de poids corporel. La DL50 aiguë pulmonaire est de 4,4 mg/kg. Avec une dose efficace de 1,6 mg/kg retenue pour l'étude de l'évolution temporelle de la toxicité pulmonaire, le poids des poumons a augmenté chez les rats traités, ainsi que le taux d'hydroxyproline pulmonaire et le nombre total de cellules trouvées dans le LBA 2, 4, 7, 14, 28 et 56 jours après le traitement. Par rapport aux témoins, les taux de protéines totales du LBA ont augmenté de 361, 615, 116, 41, 34 et 41 %, après respectivement 2, 4, 7, 14, 28 et 56 jours. L'activité de l'enzyme LDH dans le LBA a montré une augmentation significative après 1, 2, 4, 7, 14, 28 et 56 jours, et le taux de fibronectine s'est élevé de 164, 552, 490, 769, 335, 257 et 61 %, mais ni le facteur de nécrose tumorale, ni l'interleukine-1 n’ont augmenté. L'histologie des rats traités était anormale (avec une inflammation bronchiolitique et des alvéoles puis nécroses cellulaires dans les bronches aux jours 1 et 2, avec des zones d'épaississement septal, infiltration cellulaire et dépôt de collagène dans les espaces alvéolaires et intestinaux durant les jours 4 à 56). La thuringiensine purifiée présente donc une toxicité pulmonaire chez le rat et le stress oxydatif semble en cause. La thuringiensine peut aussi négativement agir sur l'adénylate cyclase dans le cerveau du rat.

À la fin des années 1970, il a été démontré que la thuringiensine (ou toxines dites Bt) est une protéine cristalline très sensible aux rayons ultraviolets solaires qui la dégradent rapidement. Elle est également très instable en phase aqueuse et sa demi-vie diminue lorsque la température monte. Le Bt utilisé en pulvérisation a donc l'avantage d'être peu rémanent sur les feuilles (un peu plus dans le sol), avec l'inconvénient d'être actif moins longtemps.

Préoccupations liées aux OGM

Les gènes cry1Ab codant la production de protéines (« delta endotoxine ») dans le maïs nord-américain proviennent de B. thuringiensis kurstaki (Btk), bactérie très pathogène pour les papillons. Certains chercheurs, dont en France l'écotoxicologue Jean-François Narbonne, ont au début des années 2000 alerté sur le fait que le Bt issu de plantes transgéniques, en s'accumulant, puisse finir par poser problème : toxicité du sol contaminé, accumulation dans les sédiments toxiques dans les fleuves et estuaires.

Des analyses faites sur 12 sites de l'Indiana (États-Unis) ont en effet montré que les taux de Bt deviennent préoccupants dans les cours d'eau, au point d'affecter certains invertébrés aquatiques jugés bioindicateurs de la qualité des écosystèmes aquatiques (ex: grande phrygane), dont la croissance est affectée par cette toxine, qui tue la phrygane à forte dose. Cette étude attribue l'origine de ce Bt aux maïs transgéniques cultivés dans les bassins versants de ces rivières. Ils y libèrent des toxines Bt dans l'environnement du bassin versant, d'où elles sont apportées jusqu'aux fossés et rivières par le ruissellement. L'étude évoque notamment pour la première fois le rôle des pollens et des déchets ou résidus de maïs comme source non négligeable de toxines. Ces derniers peuvent s'accumuler, se dégrader et être transportés par l'eau vers le bas des bassins versants. Le pollen du maïs, de forme très arrondie et dépourvu de spicules, est facilement emporté par le ruissellement et peut alors se concentrer en certains points (flaques, ornières, fossés, sédiments des cours d'eau). Les émissions massives de pollen se font en quelques jours ou semaines, à la fin du printemps et au début de l'été, à un moment important pour de nombreuses espèces (reproduction/ponte ou croissance des alevins).

Une étude a évalué la persistance du gène cry1Ab dans différentes matrices. Le gène cry1Ab s'est montré persistant pendant en moyenne 21 jours dans les eaux de surface et presque deux fois plus longtemps (41 jours) dans les sédiments. Dans les sédiments argilo-sableux, le gène était encore présent après 40 jours. L'étude a aussi montré que les gènes cry1Ab provenant du maïs transgénique ou de source naturelle sont plus abondants dans les sédiments que dans les eaux de surface. Le transgène cry1Ab est transporté par le courant. Il tend à diminuer au fur et à mesure que l'on s'éloigne des cultures de maïs Bt, et il est d'autant plus présent dans les sédiments qu'il l'est dans les eaux de surface (corrélation significative : R = 0,83 ; P = 0,04). L'étude a donc conclu que l'ADN de maïs Bt et de Bt persiste dans les milieux aquatiques et qu'il est présent dans les rivières drainant les zones agricoles et en aval.

Réglementation et sécurité du Bti (Bacillus thuringiensis var. israelensis)

Le Bacillus thuringiensis variété israelensis, couramment désigné par son acronyme Bti, est une bactérie qui vit naturellement dans les sols. Durant l'étape de sporulation de son cycle de vie, le Bti produit une protéine cristallisée, qui est toxique uniquement pour les larves de moustiques et de mouches noires. Ces cristaux microscopiques sont ingérés par les larves des insectes lorsque celles-ci se nourrissent. Dans le milieu alcalin de l'appareil digestif de ces insectes sensibles, les cristaux se dissolvent et se transforment en molécules protéiques toxiques qui détruisent les parois de l'estomac.

D'autres sous-espèces de Bt sont homologuées pour utilisation au Canada et elles aussi n'agissent que sur des espèces spécifiques d'insectes. Le Bti est pulvérisé directement sur l'eau où se trouvent des larves de moustiques et de simulies. Les bactéries en suspension dans l'eau sont alors ingérées par les larves. Au Canada, presque tous les produits renfermant du Bti sont des produits de la catégorie à usage « restreint », utilisés contre les larves de simulies et de moustiques dans des milieux aquatiques où l'écoulement de l'eau n'est pas confiné à une petite zone. Il existe aussi des produits à base de Bti à usage commercial, mais qui ne peuvent être utilisés que contre les larves de simulies et de moustiques dans les étangs privés et les étangs artificiels de fermes, où il n'y a pas d'écoulement au-delà des limites de la propriété.

Santé humaine et environnement

La manipulation du Bti ou l'exposition à des produits qui en contiennent, comme lors d'un programme provincial ou municipal de pulvérisation contre les moustiques, présente très peu de dangers directs ou indirects pour la santé humaine. L'activation des toxines du Bti n'est possible qu'en présence des conditions d'alcalinité que l'on retrouve dans l'appareil digestif de certains insectes. L'acidité de l'estomac des humains et des animaux n'active pas les toxines du Bti. Au cours des nombreuses années d'utilisation du Bti, aucun cas humain ou animal d'intoxication ou de dérèglement des fonctions endocrines n'a été signalé ni au Canada, ni à l'étranger.

Avant que la vente, l'utilisation ou l'importation d'une nouvelle formulation de Bti soient autorisées au Canada, celle-ci doit faire l'objet d'une évaluation selon des protocoles scientifiques reconnus universellement visant à établir si elle peut causer une irritation ou une sensibilisation au niveau des yeux ou de la peau ou des effets toxiques aigus. L'exposition des applicateurs lors des programmes provinciaux et municipaux de pulvérisation contre les simulies et les moustiques est minime, car le produit est appliqué directement sur l'eau où se trouvent les larves. Aucun des produits à base de Bti ne peut être appliqué sur l'eau potable traitée. En cas d'exposition fortuite au Bti, le citoyen moyen ne devrait ressentir aucun symptôme, et aucune précaution particulière n'est justifiée ni requise. Les personnes qui éprouvent malgré tout certaines craintes à l'égard du Bti devraient prendre des précautions raisonnables afin d'éviter d'être exposées durant un programme de pulvérisation, tout comme elles le feraient pour éviter d'entrer en contact avec le pollen ou d'autres matières aéroportées au cours des journées où des avertissements relatifs à la qualité de l'air sont émis. Ces personnes peuvent réduire le risque d'exposition en demeurant à l'intérieur et en fermant bien leurs portes et fenêtres lorsque des pulvérisations sont effectuées à proximité de leur habitation.

L'Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire (ARLA) doit, avant d'accepter l'utilisation d'un produit antiparasitaire au Canada, s'assurer qu'il ne présente aucun danger pour la santé humaine ou l'environnement. Les fabricants sont tenus de fournir à l'Agence les données analytiques complètes de la formulation du produit, ainsi que l'information complète sur la santé et l'environnement, de façon à permettre aux scientifiques de l'ARLA de procéder à l'évaluation des risques. L'ARLA est responsable de la classification des produits antiparasitaires au Canada et elle a classé presque tous les produits à base de Bti, utilisés contre les larves de moustiques et de simulies, dans la catégorie à usage « restreint », car ils ne peuvent être pulvérisés que sur l'eau où se trouvent les larves. Les provinces ont établi des critères pour la certification des applicateurs, et la plupart d'entre elles exigent que les applicateurs qui utilisent des produits à usage restreint soient certifiés.

En plus du Bti, matière active, d'autres substances (produits de formulation) entrent dans la composition du produit final. Les titulaires d'homologation de produits antiparasitaires sont tenus de déclarer à l'ARLA tous les produits de formulation utilisés dans leurs préparations. L'information sur les produits de formulation est considérée comme un secret commercial, et la divulgation de ce type d'information au public est interdite en vertu de la Loi sur l'accès à l'information et sur la protection des renseignements personnels. Les produits de formulation présents dans un produit antiparasitaire font l'objet d'un examen afin de déterminer s'ils présentent un risque toxicologique ou sont à l'origine de possibles signes d'irritation.

Le Bti ne devient toxique qu'une fois rendu dans l'estomac des larves de moustiques ou de simulies. Le Bti n'a donc aucun effet sur les autres insectes comme l'abeille domestique, ni sur les poissons, les oiseaux ou les mammifères. L'Environmental Protection Agency des États-Unis estime que les risques présentés par les souches de Bti pour les organismes non visés sont négligeables à nuls.

Les produits homologués contenant du Bti sont principalement destinés à être utilisés par des applicateurs formés, dans le cadre de programmes provinciaux et municipaux de pulvérisation contre les moustiques et les simulies. Les restrictions sur les étiquettes de ces produits ne permettent leur application que sur les sites aquatiques où il y a présence de larves de moustiques et de simulies, et non sur de l'eau potable traitée. Vu l'absence de risque pour la santé humaine et un long passé d'utilisation, sans aucun danger, du Bti et d'autres variétés de Bt, l'ARLA estime que la pulvérisation de produits homologués contenant un Bt sur des nappes d'eau servant à la consommation humaine ne présente aucun danger pour la santé humaine ni pour la sécurité en général. Différentes variétés de Bt, y compris le Bti, ont été largement utilisées, depuis de nombreuses années, au Canada et aux États-Unis, dans le cadre de programmes de lutte contre les insectes, et leur dossier de sécurité a toujours été excellent. Le poids de la preuve montre que le Bti est non infectieux et non toxique pour l'homme et les autres mammifères et qu'il ne présente qu'un faible risque aux doses permises pour les programmes de lutte contre les insectes.

La production de biopesticides à base de Bacillus thuringiensis

La production de biopesticides tels que le Bioval (Bacillus thuringiensis var. kurstaki) implique des processus de fermentation. Des études ont été menées pour optimiser cette production à différentes échelles. Par exemple, des recherches ont exploré la possibilité d'utiliser des eaux usées d'amidon comme substrat pour réduire les coûts de production et apporter une valeur ajoutée au biopesticide. Les résultats de la production de Bioval ont été évalués sur des fermenteurs de différentes tailles (15 L, 150 L et 2000 L), montrant des rendements élevés en unités internationales (UI/µL), par exemple 22444 UI/µL pour le fermenteur de 2000 L.

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