La maîtrise des techniques de culture et d'isolement microbien constitue le socle fondamental de toute analyse microbiologique. Que ce soit pour évaluer la potabilité d'une eau ou pour isoler des souches spécifiques à des fins industrielles, la rigueur des procédures de mise en bouillon, de dilution et de repiquage détermine la fiabilité des résultats obtenus.
Fondements de l'évaluation bactériologique de l'eau
L'évaluation de la qualité bactériologique d'une eau repose sur une interprétation précise de la charge microbienne. L'absence de micro-organismes dans une eau peut s'interpréter de deux manières : eau protégée des sources de contamination ou présence d'éléments toxiques ayant entraîné leur disparition. À l'inverse, la présence d'une quantité importante de micro-organismes révèle l'existence d'une contamination dont il faut rechercher les causes et les éléments.
La nature des micro-organismes recherchés comprend des bactéries, des levures et des moisissures se développant en aérobiose à 37°C +/- 1°C. La norme pour les eaux livrées sous forme conditionnée stipule que le nombre de micro-organismes doit être inférieur à 20/mL après 24 heures de culture, et inférieur ou égal à 200/mL après 72 heures. Les effets sur la santé dépendent évidemment des espèces de bactéries présentes dans l'eau et de leur nombre.
Principes de la préparation des milieux de culture
Les milieux de culture microbiens doivent fournir des conditions de croissance optimales. La composition précise dépend de l'espèce cultivée et de l'objectif. Les milieux sont classés selon leurs constituants chimiques, leur nature physique et leur fonction :
- Milieu synthétique (défini) : Composé chimique précis, utilisé pour les photoautotrophes comme les cyanobactéries.
- Milieu complexe : Contient des éléments non définis (peptone, extrait de viande, extrait de levure) pour répondre aux besoins nutritionnels variés.
- Milieu solide : Utilise 1 à 7 % d'agar-agar ou 10 à 20 % de gélatine.
- Milieu liquide : Ne contient pas d'agent solidifiant.
La préparation à partir de formulations commerciales déshydratées doit suivre strictement les instructions du fabricant. Les ingrédients sont dissous dans de l'eau distillée par agitation et chauffage si nécessaire. Le pH doit être ajusté avant la stérilisation par chaleur humide en autoclave. Une préparation aseptique est essentielle pour protéger les milieux de toute infection.
Procédures de prélèvement et de stérilisation
La stérilisation du matériel est une étape critique. Les méthodes incluent le four à 170°C pendant une heure, l'autoclave à 120°C pendant 20 minutes, ou la cocotte-minute pendant 40 minutes après la rotation de la soupape.
Pour le prélèvement d'eau de rivière ou de puits, on utilise une bouteille stérile lestée, maintenue à la profondeur souhaitée, puis bouchée avec du coton cardé hydrophobe recouvert d'aluminium. Pour l'eau du robinet, il convient de nettoyer l'embouchure, de laisser couler l'eau pendant 1 à 2 minutes, de stériliser à la flamme, de laisser couler à nouveau, puis de remplir en laissant un léger vide d'air. L'échantillon doit être conservé au réfrigérateur et ensemencé le plus rapidement possible.
Aseptic Technique
Techniques d'isolement : De la dilution au repiquage
Dans le milieu naturel, les micro-organismes vivent en consortiums. L'objectif de l'isolement est d'obtenir une culture pure, soit une population génétiquement identique issue d'un seul ancêtre.
La méthode de la plaque à stries
Le principe repose sur la dilution mécanique. En déplaçant une anse d'inoculation sur la surface d'une gélose (généralement en quatre quadrants), on réduit progressivement la charge microbienne jusqu'à obtenir des colonies isolées. Il est crucial d'attendre le refroidissement complet de l'anse après stérilisation à la flamme pour ne pas détruire l'inoculum. Une légère pression doit être appliquée pour ne pas entailler la gélose.
La méthode de la plaque de versement
Cette approche utilise une matrice tridimensionnelle. La suspension microbienne est diluée en série dans des tubes contenant 9 mL d'eau stérile (dilutions au 1/10, 1/100, etc.). Un volume de 1 mL de ces dilutions est déposé dans une boîte de Petri vide, puis recouvert d'agar fondu maintenu entre 45 et 50°C. Après mélange par rotation, les micro-organismes sont "figés" dans la gélose.
Incubation et dénombrement
L'incubation se fait à 37°C. Les boîtes doivent être placées couvercle vers le bas pour éviter que la condensation ne retombe sur la culture et ne perturbe la formation des colonies.
Le dénombrement repose sur le fait qu'une colonie est le résultat des divisions d'un seul micro-organisme. On marque les colonies sur le fond de la boîte avec un marqueur indélébile sans jamais ouvrir la boîte pour des raisons de sécurité. Une boîte est considérée comme lisible si la population est comprise entre 1 et 300 colonies. Le calcul du nombre de bactéries par mL doit impérativement tenir compte du facteur de dilution utilisé.
Maintenance du laboratoire et décontamination
La gestion des déchets est une composante intégrante de la procédure. Après usage, les boîtes de Petri doivent être décontaminées à l'autoclave à 120°C pendant 20 minutes ou immergées dans une solution d'eau de Javel (250 mL de berlingot complété à 1 litre avec de l'eau distillée) pendant 24 heures. La technique aseptique reste le rempart principal contre les résultats erronés, nécessitant une pratique constante et une attention rigoureuse à chaque étape du processus, de la préparation des milieux à l'observation finale des colonies.