Le Repiquage des Cellules Adhérentes : Stratégies et Innovations pour la Production à Grande Échelle

Introduction à la Culture Cellulaire Adhérente et au Repiquage

La culture cellulaire est une technique fondamentale en recherche en sciences de la vie, utilisée pour établir des modèles biologiques pertinents ou pour produire des protéines recombinantes, des particules virales ou des thérapies biologiques. Parmi les approches les plus courantes de culture de cellules mammaliennes, on trouve la culture primaire et la culture continue. Les cellules peuvent être cultivées en suspension ou sous forme de monocouche 2D qui s'attache à la fiole de culture tissulaire ou à la plaque multipuits. Les modèles de culture cellulaire 3D (organoïdes et sphéroïdes) sont généralement considérés comme imitant plus fidèlement l'environnement in vivo de la cellule que les cellules cultivées sur des surfaces 2D. Assurer une croissance cellulaire adéquate est essentiel pour collecter des données précises à partir d'études de culture cellulaire.

Le repiquage des cellules est une étape fondamentale de la culture cellulaire générale pour maintenir la santé des cellules et une croissance optimale. Il consiste à détacher les cellules de leur surface de croissance pour permettre la sous-culture ou la récolte. La dissociation des cultures cellulaires est donc une étape critique dans la maintenance des cultures cellulaires. Le processus doit préserver la viabilité des cellules, qui doit être régulièrement vérifiée pour dépasser 90 % pendant la sous-culture. Pour que la sous-culture des cellules adhérentes soit efficace, il faut les détacher du récipient de culture. Diverses méthodes sont employées, chacune étant adaptée à des types de cellules et à des conditions différentes. Lors du choix d'une méthode de dissociation, il est essentiel de prendre en compte les besoins spécifiques de la lignée cellulaire et les objectifs de l'expérience.

Le développement de la technologie de culture cellulaire sur microporteurs dans les années 80 a considérablement facilité la production à grande échelle de cellules adhérentes, et par voie de conséquence, la production d'agents biologiques. Cette avancée a ouvert la voie à des applications industrielles, notamment pour la préparation de vaccins ou de médicaments.

Les Défis de la Production à Grande Échelle de Cellules Adhérentes

La production de cellules adhérentes destinées à la fabrication d'agents biologiques pour un usage pharmaceutique doit respecter un certain nombre de prescriptions réglementaires. Une contrainte majeure est l'interdiction d'utiliser des cellules adhérentes au-delà d'un certain nombre de "passages cellulaires", car il existe un risque de transformation morphologique et/ou biologique des cellules. C'est le cas notamment des cellules de la lignée Vero, largement utilisées dans l'industrie.

Méthodes Traditionnelles de Production Industrielle

Historiquement, les procédés industriels pour produire des lots de cellules adhérentes, tels que celui décrit dans le brevet US 4,664,912, reposent sur une succession de passages cellulaires. Ces passages ont lieu à chaque fois dans des bioréacteurs différents, dont les volumes utiles augmentent au cours des passages cellulaires successifs. Cette approche permet d'augmenter la quantité de microporteurs tout en maintenant une concentration optimale en microporteurs dans le milieu de culture, généralement comprise entre 1 et 5 g/l. La biomasse cellulaire augmente ainsi au cours des passages cellulaires successifs jusqu'à l'obtention du lot industriel de cellules désiré.

La suspension de cellules obtenue est ensuite transférée (en présence ou en l'absence des microporteurs usagés) dans un bioréacteur plus grand qui contient une quantité plus importante de nouveaux microporteurs. Cependant, cette méthode de production industrielle de cellules adhérentes requiert l'utilisation et la manipulation d'un matériel important, ce qui a une incidence significative sur les coûts de production des agents biologiques.

Problématiques Associées aux Méthodes Antérieures

Pour diminuer les coûts de production de cellules adhérentes destinées à la production d'agents biologiques, certaines innovations ont été proposées. Le brevet EP 1060241, par exemple, propose une méthode de production plus rapide qui ne nécessite plus de repartir d'une semence de cellules provenant d'une banque de travail à chaque fois que l'on souhaite produire un lot industriel de cellules. Dans cette approche, 20 % des cellules restantes sont entretenues pour maintenir un stock de "cellules nourricières" à partir desquelles de nouveaux lots de cellules peuvent être produits.

Cependant, cette méthode présente un inconvénient majeur : les lots de cellules produits peuvent présenter une certaine hétérogénéité, car ils n'ont pas tous le même nombre de passages cellulaires. De plus, le maintien d'un stock de cellules "nourricières" en culture lors de chaque opération de transfert entraîne inévitablement un "vieillissement" des cellules. Ce vieillissement est directement lié au nombre de passages cellulaires effectués et ne peut donc être utilisé que pendant une période de temps limitée en raison des exigences réglementaires mentionnées précédemment.

Une autre problématique concerne l'utilisation d'enzymes protéolytiques, telles que la trypsine, pour détacher les cellules de leurs supports. Ces enzymes peuvent être néfastes à l'intégrité des cellules. Ohlson et coll. dans Cytotechnology (1994), vol 14, pages 67-80, ont décrit une technologie de transfert des cellules adhérentes de microporteur à microporteur (bead to bead transfer) en l'absence de tout traitement enzymatique. Pour favoriser la croissance cellulaire, des microporteurs nus sont ajoutés à un milieu de culture contenant des microporteurs recouverts de cellules adhérentes, et le milieu de culture est agité de façon intermittente pour favoriser le contact entre microporteurs. Néanmoins, la population de cellules produite est "désynchronisée", les cellules étant à des stades variés du cycle cellulaire, ce qui peut constituer un inconvénient majeur pour la production d'agents biologiques.

Il existe donc toujours un besoin d'optimiser les méthodes de production à grande échelle de cellules adhérentes, ainsi que la production d'agents biologiques qui en dérivent, afin de diminuer les coûts de production tout en assurant l'homogénéité et l'intégrité des cellules.

Le Procédé "All-in-One" : Une Approche Innovante pour le Repiquage

L'invention propose un procédé de production de cellules adhérentes selon lequel on introduit des cellules adhérentes dans un récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture et on effectue plusieurs passages cellulaires successifs dans ce même récipient. À chaque fois, tout ou partie de la population cellulaire du passage cellulaire précédent est utilisée pour réaliser le passage cellulaire suivant. Cette approche est particulièrement avantageuse car elle réduit le nombre de récipients de culture à utiliser, et les lots de cellules produits sont homogènes puisqu'ils ont tous le même nombre de passages cellulaires. Ce procédé sert également à la production d'agents biologiques.

Un "passage cellulaire" au sens de cette invention débute au moment où une suspension de cellules adhérentes est mise en contact avec des microporteurs dans un milieu de culture. Il se termine habituellement au moment où les cellules adhérentes sont libérées de leurs microporteurs par traitement enzymatique et se trouvent à nouveau sous la forme d'une suspension dans le milieu de culture.

Les Phases Clés d'un Passage Cellulaire

Un passage cellulaire typique dans ce procédé comprend plusieurs phases distinctes :

• Phase d'amplification des cellules adhérentes aux microporteurs : Cette période correspond au temps pendant lequel les cellules se multiplient sur les microporteurs jusqu'à ce que la surface disponible des microporteurs colonisés soit recouverte à plus de 70 %, et de façon préférée à plus de 80 %, par les cellules. C'est la phase de croissance logarithmique où les cellules se divisent activement, stade optimal pour évaluer la croissance de la population ou collecter des données.
• Phase de détachement des cellules substantiellement confluentes des microporteurs : Cette étape est réalisée au moyen d'un traitement enzymatique afin qu'un maximum de cellules soient décrochées de leur support (en général plus de 80 % et de façon préférée plus de 90 %) dans un espace de temps court (en général en moins de 30 minutes et souvent dans une période de temps inférieure à 20 minutes). La population de cellules est alors essentiellement sous la forme d'une suspension de cellules libérées de leurs microporteurs (ou détachées de leurs microporteurs).

Il est important de noter que, en fonction de l'utilisation des cellules adhérentes produites, le dernier passage cellulaire effectué dans le récipient de culture peut inclure ou non cette phase de détachement.

Réalisation des Passages Cellulaires Successifs

Dans le cadre de cette invention, les passages cellulaires successifs sont réalisés dans un seul et même récipient de culture en utilisant tout ou partie de la population cellulaire obtenue lors du passage cellulaire précédent pour réaliser le passage cellulaire suivant. Il est habituel d'utiliser au moins 80 % de la population cellulaire obtenue lors du passage cellulaire précédent. De façon préférée, pour produire une quantité maximale de cellules, on effectue les passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois toute la population cellulaire obtenue lors du passage cellulaire précédent pour réaliser le passage cellulaire suivant.

Bien qu'à la fin de chaque passage cellulaire les cellules soient libérées (détachées) de leurs microporteurs au moyen d'un traitement enzymatique, il n'est pas procédé, comme dans l'art antérieur, au transfert de la biomasse cellulaire dans un ou plusieurs autres récipients de culture cellulaire pour continuer l'amplification cellulaire. L'amplification de la biomasse cellulaire est réalisée ici dans un seul et même récipient de culture. Ce procédé est très avantageux car il permet de produire dans les mêmes délais des quantités équivalentes de cellules sans avoir à utiliser et à manipuler plusieurs récipients de culture, ce qui réduit l'espace nécessaire pour produire des quantités industrielles de cellules et par conséquent réduit sensiblement les coûts de production. L'efficacité de la mise en œuvre de ce procédé est significativement plus importante que celle obtenue en utilisant la technologie classique dite de "transfert de microporteur à microporteur".

Chaque nouveau passage cellulaire, qui correspond à un passage cellulaire ultérieur au premier passage cellulaire, est effectué dans le même récipient de culture. Pour démarrer un passage ultérieur au premier passage cellulaire, on introduit du milieu de culture et une quantité de microporteurs plus importante que la quantité de microporteurs qui a été introduite lors du passage cellulaire précédent, de façon à augmenter la surface du support cellulaire disponible. L'introduction ou l'addition de microporteurs dans le récipient de culture correspond à l'introduction de microporteurs nus. De façon préférée, des microporteurs non usagés sont utilisés pour faciliter l'adhésion des cellules adhérentes.

Même si habituellement le volume de milieu de culture est augmenté de façon concomitante à chaque passage ultérieur au premier passage cellulaire, généralement l'augmentation de la quantité de microporteurs est proportionnellement plus importante que l'augmentation de volume de milieu. Cela se traduit généralement par une augmentation progressive de la concentration en microporteurs dans le milieu de culture au cours des passages cellulaires successifs. La concentration en microporteurs peut atteindre jusqu'à 15 g/l.

Le procédé de l'invention, selon lequel la biomasse cellulaire est augmentée par passages cellulaires successifs dans un seul et même récipient de culture, est dénommé "procédé all in one". Habituellement, 2, 3 ou 4 passages cellulaires sont effectués dans le même récipient de culture.

Mise en Œuvre Détaillée du Procédé "All-in-One"

Le procédé de production de cellules adhérentes peut être décrit en une série d'étapes :

a. Introduction de cellules adhérentes congelées dans un premier récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture.b. Soumission des cellules à des conditions de culture qui leur permettent d'adhérer et de proliférer sur les microporteurs.c. Lorsque les cellules sont substantiellement confluentes, détachement des cellules de leurs microporteurs au moyen d'un traitement enzymatique.d. Introduction de la population cellulaire obtenue après l'étape c) dans le même récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture.e. Soumission à nouveau des cellules à des conditions de culture qui leur permettent d'adhérer et de proliférer sur les microporteurs.f. Récolte de la population cellulaire obtenue après avoir éventuellement détaché les cellules de leurs microporteurs au moyen d'un traitement enzymatique.

Les étapes a) à c) correspondent au premier passage cellulaire et les étapes d) à f) correspondent au deuxième passage cellulaire qui se termine par la récolte des cellules. Lorsqu'il y a plus de deux passages cellulaires successifs réalisés dans le même récipient, cela revient à répéter à nouveau les étapes c), d) et e) après l'étape e) dans le même récipient de culture avant de mettre en œuvre l'étape f) de récolte des cellules.

Considérations Pratiques et Optimisations

• Nombre de passages cellulaires : Généralement, le nombre de passages cellulaires effectués dans le même récipient de culture est de 2, 3 ou 4.
• Concentration en microporteurs : La concentration en microporteurs dans le milieu de culture pendant le premier passage cellulaire est généralement inférieure à 1 g/l, et de façon préférée inférieure à 0,5 g/l. À chaque passage ultérieur, la quantité de microporteurs est augmentée.
• Traitement enzymatique : De façon très préférée, le traitement enzymatique emploie une solution contenant une enzyme protéolytique, telle que la trypsine.
• Volume du milieu de culture : Chaque passage cellulaire ultérieur au premier passage cellulaire est réalisé en augmentant le volume du milieu de culture. De façon préférée, le premier passage cellulaire est effectué dans un volume de milieu de culture qui est entre 1/5 et la moitié du volume utile du récipient de culture.
• Milieu de culture : De façon préférée, le milieu de culture est dépourvu de produit d'origine animale. Les milieux de culture pour cellules mammaliennes doivent maintenir un pH physiologique, en plus de fournir des sels équilibrés, des glucides, des acides aminés, des vitamines, des acides gras et des lipides, des protéines et des peptides, des oligo-éléments et des facteurs de croissance. Le sérum bovin fœtal (FBS) est le supplément de croissance le plus largement utilisé pour la culture de cellules mammaliennes, car il contient de nombreux nutriments cellulaires essentiels et a démontré son soutien à la croissance des cellules et des tissus en culture. Les milieux et les suppléments fournissent souvent de riches nutriments pour la croissance de microbes opportunistes, une technique aseptique et une observation régulière sont donc nécessaires pour assurer l'absence de contaminants.
• Agent protecteur cellulaire : Le milieu de culture peut contenir en outre un agent protecteur cellulaire, tel qu'une polyvinylpyrrolidone ou un poloxamère, pour préserver autant que possible l'intégrité des cellules.
• Récipient de culture : Le récipient de culture est un bioréacteur ayant un volume utile compris entre 3 et 3000 litres, de façon préférée entre 20 et 1000 litres et de façon particulièrement préférée entre 20 et 500 litres. Dans un autre mode, le récipient de culture est un bioréacteur à usage unique.
• Type de cellules : Dans un aspect particulier du procédé, les cellules adhérentes sont des cellules Vero.
• Rendement cellulaire : De façon générale, la population cellulaire qui est récoltée contient une quantité de cellules qui est au moins 60 fois plus importante que la quantité de cellules qui a été initialement introduite dans le récipient de culture.

Production d'Agents Biologiques

L'invention concerne également l'utilisation des cellules produites selon ce procédé pour la production d'agents biologiques. Le processus implique :a. La culture des cellules adhérentes.b. La soumission de la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire à un traitement, puis la récolte de l'agent biologique.

Selon un aspect du procédé de production de l'agent biologique, l'agent biologique est un agent infectieux et le traitement de la population cellulaire est effectué en infectant la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire avec ledit agent infectieux dans un milieu d'infection. Selon un aspect particulier, l'agent infectieux est le virus rabique et le milieu d'infection est un milieu d'infection virale dépourvu de tout produit d'origine animale.

La population cellulaire peut être récoltée sous la forme d'une suspension de cellules libérées de leur microporteur (dans ce cas, le dernier passage cellulaire est effectué en incluant l'étape de détachement cellulaire) soit, sous la forme d'une suspension de cellules adhérentes aux microporteurs (dans ce cas le dernier passage cellulaire est effectué en omettant l'étape de détachement cellulaire).

Protocole de Subculture de Cellules Adhérentes

Pour un repiquage réussi des cellules adhérentes, une série d'étapes précises doit être suivie. Il est recommandé de suivre attentivement les instructions fournies avec chaque produit utilisé, en particulier concernant la formulation du milieu de croissance complet. Les conséquences d'un écart par rapport aux conditions de culture spécifiées pour un type cellulaire particulier peuvent aller de l'expression de phénotypes aberrants à un échec complet de la culture cellulaire.

Préparation et Surveillance

Avant le repiquage, assurez-vous que les solutions et l'équipement qui entrent en contact avec les cellules sont stériles. Utilisez une technique stérile appropriée tout au long de la procédure de sous-culture et travaillez sous une hotte à flux laminaire. Surveillez régulièrement la viabilité de vos cellules avant la sous-culture. Les cellules adhérentes doivent être repiquées en phase exponentielle (log phase) avec une viabilité supérieure à 90 % au moment de la sous-culture.

Étapes de Dissociation Cellulaire

1. Retrait du milieu de culture usagé : Retirez et jetez le milieu de culture cellulaire usagé du récipient de culture.
2. Lavage des cellules : Lavez les cellules à l'aide d'une solution saline équilibrée sans calcium ni magnésium (environ 2 ml par 10 cm² de surface de culture). Ajoutez délicatement la solution de lavage sur le côté du récipient opposé à la couche cellulaire attachée pour éviter de perturber la couche cellulaire, et balancez le récipient d'avant en arrière plusieurs fois. L'étape de lavage élimine toute trace de sérum, de calcium et de magnésium qui inhiberait l'action du réactif de dissociation.
3. Retrait de la solution de lavage : Retirez et jetez la solution de lavage du récipient de culture.
4. Ajout du réactif de dissociation : Ajoutez le réactif de dissociation préchauffé, tel que la trypsine ou TrypLE, sur le côté de la fiole ; utilisez suffisamment de réactif pour couvrir la couche cellulaire (environ 0,5 ml par 10 cm²). Agitez doucement le récipient pour obtenir une couverture complète de la couche cellulaire.
5. Incubation : Incubez le récipient de culture à température ambiante pendant environ 2 minutes. Le temps d'incubation réel varie selon la lignée cellulaire utilisée.
6. Observation du détachement : Observez les cellules au microscope pour vérifier leur détachement. Si moins de 90 % des cellules sont détachées, augmentez le temps d'incubation de quelques minutes, en vérifiant la dissociation toutes les 30 secondes. Vous pouvez également tapoter le récipient pour accélérer le détachement des cellules.
7. Récupération des cellules détachées : Lorsque ≥ 90 % des cellules sont détachées, inclinez le récipient pendant un laps de temps minimal pour permettre aux cellules de s'égoutter. Ajoutez l'équivalent de 2 volumes (deux fois le volume utilisé pour le réactif de dissociation) de milieu de croissance complet préchauffé. Dispersez le milieu en pipettant plusieurs fois sur la surface de la couche cellulaire.
8. Transfert et centrifugation : Transférez les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifugez-les à 200 x g pendant 5 à 10 minutes. La vitesse et le temps de centrifugation varient en fonction du type de cellule.
9. Resuspension et comptage : Resuspendre le culot cellulaire dans un volume minimal de milieu de croissance complet préchauffé et prélever un échantillon pour le comptage. Déterminez le nombre total de cellules et le pourcentage de viabilité à l'aide d'un hémocytomètre et du protocole d'exclusion au bleu trypan, ou du compteur cellulaire automatisé Invitrogen Countess. Si nécessaire, ajoutez du milieu de croissance aux cellules pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée et recomptez les cellules.
10. Dilution et ensemencement : Diluez la suspension cellulaire jusqu'à la densité d'ensemencement recommandée pour la lignée cellulaire, puis pipettez le volume approprié dans de nouveaux récipients de culture cellulaire et replacez les cellules dans l'incubateur.

Considérations Spécifiques pour les Cellules d'Insectes

Bien que la procédure générale de sous-culture des cellules d'insectes suive les mêmes étapes que celle des cellules de mammifères, certaines exigences clés de ces systèmes de culture sont différentes.

• Moment du repiquage : Repiquez les cellules d'insectes en phase exponentielle, avant qu'elles n'atteignent la confluence, à moins que vos cellules ne soient fortement adhérentes. Si vos cellules d'insectes sont fortement adhérentes, vous pouvez les repiquer à la confluence ou légèrement après, lorsqu'elles commencent à se décoller du fond de la fiole, car elles seront plus faciles à déloger. Cependant, les cellules d'insectes qui sont repiquées à plusieurs reprises à des densités dépassant la confluence présentent des temps de doublement réduits, une viabilité diminuée et une capacité d'attachement réduite.
• Force mécanique : En revanche, le repiquage des cellules d'insectes en culture adhérente avant qu'elles n'atteignent la confluence nécessite plus de force mécanique pour les déloger de la monocouche. Lorsqu'elles sont sous-cultivées à plusieurs reprises avant la confluence, ces cellules présentent également des temps de doublement réduits, une viabilité diminuée et sont considérées comme malsaines.
• Conditions environnementales : Maintenez les cellules d'insectes à 27°C dans un environnement non humidifié. Les cellules peuvent être maintenues à température ambiante sur la paillasse si elles sont protégées de la lumière ou dans un tiroir. Cependant, un environnement contrôlé à 27°C est recommandé. L'échange de CO2 n'est pas recommandé pour la culture de cellules d'insectes.
• Milieu de culture : Utilisez des milieux spécifiquement formulés pour la croissance des cellules d'insectes. Les cellules d'insectes sont cultivées dans des milieux de croissance qui sont généralement plus acides que ceux utilisés pour les cellules de mammifères, tels que le milieu de Grace.
• Détachement des cellules en conditions sans sérum : Les cellules d'insectes s'attachent très fortement aux substrats dans des conditions sans sérum et nécessitent un effort supplémentaire pour se détacher. Pour déloger les cellules, il peut être nécessaire de secouer rapidement la fiole d'un mouvement du poignet.

Environnement et Équipement de Culture Cellulaire

La culture cellulaire est un domaine qui repose sur des pratiques rigoureuses et l'utilisation d'équipements spécialisés pour garantir la santé et la prolifération des cellules.

Plastiques et Surfaces de Culture

Les cellules cultivées sont cultivées et manipulées à l'aide de plastiques stériles à usage unique, y compris des fioles de culture tissulaire et des plaques multipuits, des pipettes sérologiques, des filtres de bouteille stériles et des filtres de seringue stériles. Les fioles et plaques de culture tissulaire en plastique sont généralement traitées pour fournir une surface hydrophile afin de faciliter l'attachement des cellules adhérentes. Pour améliorer la liaison cellulaire, on peut utiliser des revêtements comme la Poly-Lysine, qui optimise l'interaction électrostatique sur les surfaces de culture pour une meilleure adhérence cellulaire. La fibronectine diluée est également utilisée pour l'attachement cellulaire, la dilution variant selon le type de cellule.

Conditions d'Incubation

Les récipients de culture contenant des cellules et des milieux doivent être maintenus à la température et dans l'environnement gazeux qui recréent ces paramètres dans l'organisme dont ils sont dérivés. Les récipients de culture sont généralement maintenus dans des incubateurs qui offrent un contrôle précis de la température et des mélanges gazeux.

Ressources Éducatives

De nombreuses ressources éducatives sont disponibles pour améliorer la compréhension et l'application des techniques de culture cellulaire. Les centres d'apprentissage sur la culture cellulaire et la transfection offrent des ressources pédagogiques pour une excellente planification et exécution des expériences. Les bases de la culture cellulaire de Gibco™ expliquent les meilleures pratiques et les principes fondamentaux de la culture cellulaire, y compris la technique aseptique et les méthodes de croissance et de maintenance des cellules en culture. Des vidéos sur la culture cellulaire fournissent des informations précieuses sur les techniques et les ressources, et permettent de rester à jour avec les dernières avancées dans le domaine. Des outils de sélection de la culture cellulaire aident à trouver les bons produits de culture cellulaire pour la recherche.

Critères de Qualité et Éviter les Contaminations

Un contrôle régulier de la viabilité des cellules, avec un objectif de plus de 90 % au moment de la sous-culture, est essentiel pour la santé et la productivité continues de la culture. Les cellules doivent être repiquées en phase de croissance logarithmique, qui est le meilleur stade pour évaluer la croissance de la population ou collecter des données.

Les milieux et les suppléments fournissent souvent de riches nutriments pour la croissance de microbes opportunistes. Une technique aseptique et une observation régulière sont donc nécessaires pour assurer l'absence de contaminants qui peuvent provoquer la mort cellulaire ou masquer une croissance in vivo. Pour les contaminants microbiens courants qui ne peuvent pas être observés au microscope, un dépistage de routine avec des réactifs de détection de mycoplasmes protège les cultures et les environnements de propagation tissulaire.

La cryoconservation affecte la récupération post-décongélation, la viabilité et la fonctionnalité des cellules. Des protocoles appropriés de cryoconservation sont donc essentiels pour maintenir la qualité des semences cellulaires.

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